Deep Visual Proteomics définit

Nature Biotechnology volume 40, pages 1231–1240 (2022)Citer cet article

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Malgré la disponibilité de méthodes basées sur l'imagerie et la spectrométrie de masse pour la protéomique spatiale, un défi majeur reste la connexion d'images avec des mesures d'abondance de protéines à résolution unicellulaire. Ici, nous introduisons Deep Visual Proteomics (DVP), qui combine l'analyse d'images de phénotypes cellulaires basée sur l'intelligence artificielle avec une microdissection laser automatisée à cellule unique ou à noyau unique et une spectrométrie de masse à ultra-haute sensibilité. Le DVP relie l'abondance des protéines à des phénotypes cellulaires ou subcellulaires complexes tout en préservant le contexte spatial. En excisant individuellement les noyaux de la culture cellulaire, nous avons classé des états cellulaires distincts avec des profils protéomiques définis par des protéines connues et non caractérisées. Dans un tissu de mélanome primaire archivé, DVP a identifié des changements de protéome résolus dans l'espace alors que les mélanocytes normaux passent à un mélanome totalement invasif, révélant des voies qui changent de manière spatiale à mesure que le cancer progresse, telles que la dérégulation de l'épissage de l'ARNm dans la croissance verticale métastatique qui coïncide avec une signalisation réduite de l'interféron et présentation de l'antigène. La capacité du DVP à conserver des informations protéomiques spatiales précises dans le contexte tissulaire a des implications pour le profilage moléculaire des échantillons cliniques.

La polyvalence, la résolution et la nature multimodale de la microscopie moderne fournissent des images de plus en plus détaillées de l'hétérogénéité des cellules individuelles et de l'organisation des tissus1. Actuellement, un sous-ensemble prédéfini de protéines est généralement ciblé, bien en deçà de la complexité réelle du protéome. Profitant de la sensibilité considérablement accrue de la technologie basée sur la spectrométrie de masse (MS), nous avons décidé de permettre l'analyse des protéomes dans leur contexte subcellulaire natif pour explorer leur contribution à la santé et à la maladie. Nous avons combiné l'imagerie à résolution submicronique, l'analyse d'images pour le phénotypage unicellulaire basé sur l'intelligence artificielle (IA) et l'isolement avec un flux de travail protéomique ultra-sensible2 (Fig. 1). Les principaux défis se sont avérés être la définition précise des limites unicellulaires et des classes de cellules ainsi que le transfert des caractéristiques définies automatiquement dans des échantillons protéomiques, prêts pour l'analyse. À cette fin, nous introduisons le logiciel 'BIAS' (Biology Image Analysis Software), qui coordonne les microscopes à balayage et de microdissection laser (LMD). Cela combine de manière transparente l'imagerie riche en données de cultures cellulaires ou de tissus de biobanque archivés (fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE)) avec la segmentation cellulaire basée sur l'apprentissage en profondeur et l'identification basée sur l'apprentissage automatique des types et des états cellulaires. Les objets d'intérêt cellulaires ou subcellulaires sont sélectionnés par l'IA seule ou après instruction avant d'être soumis à un LMD automatisé et à un profilage protéomique. Les données générées par DVP peuvent être exploitées pour découvrir des signatures protéiques fournissant des informations moléculaires sur la variation du protéome au niveau phénotypique tout en conservant des informations spatiales complètes.

DVP combine l'imagerie haute résolution, l'analyse d'images guidée par l'IA pour la classification et l'isolement des cellules individuelles avec un flux de travail protéomique ultra-sensible2. Le DVP relie l'imagerie riche en données de la culture cellulaire ou des tissus de la biobanque de patients archivés à la segmentation cellulaire basée sur l'apprentissage en profondeur et à l'identification basée sur l'apprentissage automatique des types et des états cellulaires. Les objets d'intérêt cellulaires ou subcellulaires classés par IA (non) supervisés subissent un profilage protéomique automatisé basé sur LMD et MS. L'analyse ultérieure des données bioinformatiques permet à l'exploration de données de découvrir les signatures protéiques, fournissant des informations moléculaires sur la variation du protéome dans les états de santé et de maladie au niveau des cellules individuelles. tSNE, plongement de voisins stochastiques distribués en t.

Les aspects liés à la microscopie du flux de travail DVP s'appuient sur l'imagerie haute résolution sur lame entière, l'apprentissage automatique (ML) et l'apprentissage en profondeur (DL) pour l'analyse d'images.

Tout d'abord, nous avons utilisé la microscopie à balayage pour obtenir des images de diapositives entières à haute résolution et développé une suite logicielle pour l'analyse d'image intégrative appelée « BIAS » (Methods). BIAS traite plusieurs formats de fichiers d'image de microscopie bidimensionnelle (2D) et tridimensionnelle (3D), prenant en charge les principaux fournisseurs de microscopes et formats de données. Il combine le prétraitement d'image, la segmentation d'image basée sur DL, l'extraction de caractéristiques et la classification de phénotype basée sur ML. En nous appuyant sur un récent algorithme basé sur DL pour la segmentation du cytoplasme et du noyau3, nous avons entrepris plusieurs optimisations pour mettre en œuvre des algorithmes de prétraitement afin de maintenir des images de haute qualité sur de grands ensembles de données d'images. Les méthodes DL nécessitent de grands ensembles de données d'entraînement, ce qui représente un défi considérable en raison de la taille limitée des données d'entraînement de haute qualité4. Pour relever ce défi, nous avons utilisé nucleAIzer3 et appliqué un transfert de style d'image spécifique au projet pour synthétiser des images de microscopie artificielle ressemblant à des images réelles. Cette approche est intrinsèquement adaptable à différents scénarios biologiques, tels que de nouveaux types de cellules et de tissus ou des techniques de coloration5. Nous avons formé un réseau de neurones profonds avec ces images synthétiques pour une segmentation spécifique du compartiment cellulaire d'intérêt (par exemple, noyau ou cytoplasme ; Fig. 2a). Nous l'avons comparé à deux approches DL principales - unet4nuclei6 et Cellpose7 - et à une méthode adaptative largement utilisée basée sur un seuil et basée sur le fractionnement d'objets8. Nos algorithmes de segmentation des cellules et des noyaux des cultures cellulaires et des tissus ont montré la plus grande précision (Fig. 2b, Données étendues Fig. 1a, Tableau 1 et Tableau supplémentaire 1). Nos résultats d'analyse comparative actuels sont étayés par une étude précédente3 dans laquelle nous avons effectué une comparaison approfondie avec d'autres méthodes et logiciels (par exemple, ilastik9, sur un grand ensemble d'images de microscopie hétérogène). Pour la découverte interactive de phénotypes cellulaires, BIAS effectue une extraction de caractéristiques phénotypiques, en tenant compte de la morphologie et des caractéristiques de voisinage basées sur le ML supervisé et non supervisé (données étendues Fig. 1b et méthodes). La classification phénotypique basée sur les caractéristiques est facilement combinée avec le niveau d'expression des biomarqueurs à partir de la coloration des anticorps pour une classification précise des cellules. ML a déjà été utilisé pour l'analyse d'images et la sélection de cellules, mais pas combiné avec une protéomique impartiale10. De plus, nous avons étendu BIAS avec une interface Python ; ainsi, l'accès et la manipulation des données sont également possibles en utilisant les fonctions Python standard de manière générique, y compris l'intégration de packages open source et d'algorithmes personnalisés.

a, segmentation du noyau et du cytoplasme par l'IA de cellules et de tissus d'apparence normale et cancéreuses à l'aide de BIAS. b, Nous avons évalué la précision de son approche de segmentation à l'aide de la métrique F1 et comparé les résultats à trois méthodes supplémentaires - M1 est unet4nuclei6, M2 est CellProfiler8 et M3 est Cellpose7 - tandis que OUR fait référence à nucleAIzer3. Les barres montrent les scores F1 moyens avec sem ; n = 10 images indépendantes pour le tissu de mélanome et les cellules (U2OS), et n = 20 pour le tissu des glandes salivaires. Représentation visuelle des résultats de segmentation : les zones vertes correspondent aux vrais positifs, les bleues aux faux positifs et les rouges aux faux négatifs. c, BIAS sert d'interface entre le balayage et un microscope LMD, permettant des transferts de haute précision des contours cellulaires entre les microscopes. Illustration du décalage de coupe par rapport à l'objet d'intérêt et de la recherche de trajectoire optimale. d, Illustration pratique des fonctions dans le panneau supérieur. e, coloration par immunofluorescence de l'épithélium des trompes de Fallope humaine avec les anticorps FOXJ1 et EpCAM, détectant respectivement les cellules ciliées et épithéliales. Panneau de gauche : cellules ciliées (FOXJ1-positives) et sécrétoires (FOXJ1-négatives). Panneau de droite : classification des cellules basée sur l'intensité de FOXJ1. Classe 1 (FOXJ1-positif) et classe 2 (FOXJ1-négatif); facteur de grossissement = ×387. f, PCA des protéomes cellulaires FOXJ1-positifs et FOXJ1-négatifs. g, Carte thermique des marqueurs protéiques connus pour les cellules sécrétoires et ciliées. Les niveaux de protéines sont notés z. Les astérisques représentent les données imputées. La liste des marqueurs a été dérivée du projet Human Protein Atlas20 et basée sur l'exploration de la littérature. h, Volcano plot de la comparaison protéomique par paires entre les cellules FOXJ1-positives et FOXJ1-négatives. Les protéines marqueurs spécifiques au type de cellule sont surlignées en vert et turquoise, et le noir représente de nouvelles protéines marqueurs potentielles. Des protéines spécifiques de type cellulaire enrichies significatives sont affichées au-dessus des lignes noires (test t bilatéral, FDR < 0,05, s0 = 0,1, n = 4 répétitions biologiques).

Pour extraire physiquement les caractéristiques cellulaires découvertes avec BIAS, nous avons développé une interface entre les microscopes à balayage et LMD (actuellement Zeiss PALM MicroBeam et Leica LMD6 et LMD7) (Fig. 2c). BIAS transfère les contours cellulaires entre les microscopes, en préservant une précision totale. LMD a une précision théorique de 70 nm avec un objectif ×150, mais en pratique on atteint 200 nm. Après optimisation, le LMD7 peut exciser de manière autonome 1 250 contours haute résolution par heure, ce qui équivaut à 50 à 100 cellules par échantillon (Méthodes). Pour éviter les dommages potentiels induits par laser aux membranes cellulaires, nous excisons les contours avec un décalage (Fig. 2c, d et vidéos supplémentaires 1 et 2).

Les méthodes LMD actuelles préservent le contexte spatial mais sont principalement limitées aux phénotypes observables à l'œil humain et nécessitent une sélection manuelle des cellules, ce qui entraîne souvent le mélange de différents types de cellules, ce qui limite le débit et la découverte de novo11.

Pour explorer la sensibilité, la spécificité et la robustesse de notre flux de travail DVP, nous avons obtenu du tissu de trompe de Fallope humaine normale et séparé les cellules ciliées des cellules sécrétoires - les deux principaux types de cellules de l'épithélium de la trompe de Fallope12 - en utilisant le facteur de transcription spécifique à la lignée cellulaire FOXJ1, un régulateur principal de la fonction des cils et mesuré leurs protéomes (Fig. 2e – h, données étendues Fig. 1c – f et tableau supplémentaire 2). Nous avons uniquement détecté FOXJ1 (cellules ciliées) dans des cellules colorées par FOXJ1 (Fig. 2e, g), ainsi que plus de 5 000 autres protéines quantifiées avec d'excellentes corrélations de réplicats biologiques (Extended Data Fig. 1d, e). L'analyse bioinformatique des différences d'abondance des protéines reflétait les caractéristiques biologiques des différents types de cellules. (Fig. 2f–h et données étendues Fig. 1c–f). Ceci a été conduit par des marqueurs protéiques connus des cellules ciliées et étendu à des protéines non encore fonctionnellement associées à ces types de cellules. Nous avons utilisé l'épithélium des trompes de Fallope comme exemple pour souligner l'importance de la combinaison de la coloration des tissus à base d'anticorps et de la protéomique quantitative impartiale. De telles comparaisons de types cellulaires in vivo permettront la découverte de marqueurs de type cellulaire et d'état cellulaire et fourniront des informations impartiales pour comprendre les états pathologiques au niveau du protéome global. Il convient de noter que le cancer séreux de l'ovaire de haut grade prend naissance dans l'épithélium des trompes de Fallope, et notre méthode peut maintenant être appliquée pour étudier l'apparition précoce de la maladie sans mélanger des types de cellules non apparentés13.

Nous avons appliqué notre flux de travail à une lignée cellulaire cancéreuse non perturbée pour déterminer si le DVP peut caractériser l'hétérogénéité fonctionnelle entre des cellules ostensiblement similaires (cellules U2OS basées sur l'ubiquitination fluorescente (FUCCI)14). Après une segmentation basée sur DL pour la détection des noyaux et de la membrane cellulaire, nous avons isolé 80 à 100 cellules individuelles ou 250 à 300 noyaux par phénotype (Figs. 2c, d et 3a, b). L'analyse de petits nombres de cellules par MS est un objectif de longue date, freiné par de formidables défis analytiques dans le transfert, le traitement et l'analyse d'échantillons minuscules15, que nous avons abordés à notre tour. Nous avons traité les échantillons à l'aide de notre flux de travail récemment développé pour une entrée d'échantillon ultra-faible2,16, qui omet toutes les étapes de transfert d'échantillon et assure la dé-réticulation dans de très faibles volumes (Méthodes). Nous avons constaté que les échantillons pouvaient être analysés directement à partir de 384 puits sans aucun transfert ou nettoyage d'échantillon supplémentaire. Pour les mesures MS, nous avons utilisé une méthode d'acquisition indépendante des données utilisant une accumulation parallèle-fragmentation en série avec une dimension supplémentaire de mobilité des ions et une récupération optimale des ions de fragment (diaPASEF) sur un spectromètre de masse nouvellement développé2,17. Les répliques des protéomes cellulaires et du noyau ont démontré une reproductibilité quantitative élevée (Pearson r = 0, 96) et les protéomes des cellules entières différaient de ceux des noyaux seuls, comme prévu par les expériences de protéomique subcellulaire basées sur la séparation biochimique (données étendues Fig. 2a, b). Dans l'analyse d'enrichissement bioinformatique, des termes tels que membrane plasmique, mitochondrie, nucléosomes et complexes de facteurs de transcription étaient très significatifs (taux de fausse découverte (FDR) <10−5) (Fig. 3c).

a, Segmentation de cellules entières et de noyaux dans des cellules U2OS colorées au BIAS d'ADN (DAPI). Barre d'échelle, 20 μm b, LMD automatisé de cellules entières et de noyaux dans des plaques de 384 puits. Les images montrent des puits après la collecte. c, Niveaux relatifs de protéines (axe x) des principaux compartiments cellulaires entre la cellule entière (n = 3 répétitions biologiques) et les noyaux (n = 3 répétitions biologiques) des protéomes spécifiques. l'axe y affiche la densité de points. d, à gauche : flux de travail conceptuels du modèle de recherche de phénotype de BIAS pour la classification basée sur ML des phénotypes cellulaires. À droite : résultats de la classification non supervisée basée sur ML de six classes de noyaux U2OS distinctes en fonction des caractéristiques morphologiques et de l'intensité de la coloration de l'ADN. Les couleurs représentent les classes. Barre d'échelle, 20 μm. e, caractéristiques phénotypiques utilisées par ML pour définir six classes de noyaux distinctes. Les tracés radar montrent les niveaux relatifs notés z des caractéristiques morphologiques (zone nucléaire, périmètre, solidité et facteur de forme) et l'intensité de la coloration de l'ADN (signal DAPI total). f, Exemples d'images de noyaux des six classes identifiées par ML. La couleur bleue montre l'intensité de la coloration de l'ADN et la couleur rouge montre l'intensité de la coloration EdU pour identifier les cellules en cours de réplication. Les noyaux représentés sont agrandis pour la visualisation et ne reflètent pas les tailles réelles. g, PCA de cinq classes d'interphase basées sur 3 653 groupes de protéines après filtrage des données. Les réplicats de classes (n = 3 réplicats biologiques) sont mis en évidence par des ellipses avec un intervalle de confiance de 95 %. h, Analyse d'enrichissement des protéines régulées parmi les cinq classes de noyaux. Des protéines significatives (515 ANOVA significatives, FDR < 0,05, s0 = 0,1) ont été comparées à l'ensemble de protéines inchangées basées sur Gene Ontology Biological Process (GOBP), les voies Reactome ainsi que les annotations du cycle cellulaire et du cancer dérivées du Human Protein Atlas ( HPA)20. Un test exact de Fisher avec un FDR de Benjamini-Hochberg de 0, 05 a été utilisé (tableau supplémentaire 3). i, Regroupement hiérarchique non supervisé des 515 groupes de protéines significatifs ANOVA (tableau supplémentaire 4). Les protéines régulées par le cycle cellulaire rapportées par le HPA sont indiquées dans la barre inférieure. Les classes de noyaux (n = 3 répétitions biologiques) sont affichées dans la barre de rangée. C1–C4 montrent des clusters régulés positivement dans les différentes classes de noyaux. j, Analyse de réseau des voies enrichies pour les clusters de protéines C1-C4. L'analyse d'enrichissement des voies a été réalisée avec le package ClusterProfiler R36. ER, réticulum endoplasmique ; PC, composant principal.

Pour déterminer si les différences morphologiques entre les noyaux se reflètent également dans leurs protéomes, nous avons utilisé un modèle de recherche de phénotype non supervisé pour identifier des groupes de noyaux morphologiquement distincts en fonction de la zone nucléaire, du périmètre, du facteur de forme, de la solidité et de l'intensité de la coloration de l'ADN (Fig. 3d). ML a trouvé trois classes de noyaux primaires (27 à 37% chacune) et en a également identifié trois rares (2 à 4% chacune) (Extended Data Fig. 2c). Les six classes de noyaux distinctes résultantes présentaient des différences visibles de taille et de forme, la classe 1 représentant les états mitotiques et les cinq classes restantes représentant l'interphase avec une pondération variable des caractéristiques (Fig. 3e, f). Nous nous sommes concentrés sur ces cinq classes de noyaux d'origine inconnue pour une analyse ultérieure. Dans l'analyse en composantes principales (ACP), les répliques des protéomes respectifs se sont regroupées étroitement et les classes les plus fréquentes (2, 3 et 5) se sont regroupées (Fig. 3g). Pour vérifier et quantifier cette observation, nous avons comparé le protéome de chaque classe cellulaire à un protéome de tous les noyaux « mixtes » dans un champ de vision. Cela a révélé que les classes de cellules les plus rares avaient le plus grand nombre de protéines exprimées de manière différentielle par rapport aux protéomes «en vrac» non classés (données étendues Fig. 2d, e). Nous avons ensuite demandé si les différences protéomiques entre les cinq classes de noyaux suggéraient des différences fonctionnelles entre les états d'interphase (Fig. 3d, f). Les 515 protéines exprimées de manière significativement différentielle dans toutes les classes ont été enrichies en protéines nucléaires et liées au cycle cellulaire (par exemple, « commutation des origines vers un état post-réplicatif » et « condensation des chromosomes en prophase »), suggérant que le cycle cellulaire est un facteur fonctionnel. conducteur de séparation (Fig. 3h – j, données étendues Fig. 2f et tableaux supplémentaires 3 et 4). En comparant nos données à un ensemble de données d'imagerie unicellulaire de protéines régulées par le cycle cellulaire19, nous avons constaté un enrichissement significatif de nos protéines régulées (FDR < 10−6). La zone nucléaire, l'une des caractéristiques motrices parmi les différentes classes identifiées, a augmenté pendant l'interphase des cellules G1 aux cellules S / G2 (Fig. 3e et Données étendues Fig. 3a – c), ce qui renforce encore l'importance du cycle cellulaire dans la définition des noyaux Des classes.

Nos protéomes de type unicellulaire ont découvert plusieurs protéines non caractérisées, présentant une opportunité de les associer à une fonction cellulaire potentielle. En se concentrant sur C11orf98, C7orf50, C1orf112 et C19orf53, qui sont restés après le filtrage des données (ANOVA P <0, 05), ont montré des modèles d'expression spécifiques à la classe (Extended Data Fig. 3d). C7orf50 était le plus fortement exprimé dans les nucléoles des noyaux des classes 2, 4 et 3, qui présentaient des caractéristiques spécifiques à S / G2 (Fig. 3f et Extended Data Fig. 3d, e), suggérant que son expression est régulée par le cycle cellulaire. En effet, nous avons confirmé des niveaux plus élevés de C7orf50 dans G1/S et S/G2 par rapport aux cellules en phase G1 (Extended Data Fig. 3e). Comme les protéines régulées par le cycle cellulaire peuvent être associées au pronostic du cancer19, nous avons étudié C7orf50 dans l'atlas de pathologie humaine20 où une expression élevée était associée à des résultats favorables dans le cancer du pancréas (Extended Data Fig. 3g; P <0,001). L'analyse bioinformatique a révélé une interaction, une co-expression et une co-localisation avec la protéine LYAR («cell growth-regulating nucleolar protein»), suggérant un lien fonctionnel avec la prolifération cellulaire (Extended Data Fig. 3f, h).

La classe 6 a montré une signature protéomique intrigante indépendante des marqueurs connus du cycle cellulaire (Fig. 3i, j). Ces noyaux rares en forme de haricot ont montré une régulation à la hausse de protéines spécifiques du cytosquelette et de l'adhésion cellulaire (par exemple, VIM, TUBB, ACTB et ITGB1), suggérant que ces signatures provenaient de cellules migrantes subissant une déformation nucléaire, suggérant une invasion cellulaire. Notez que nous avons classé les noyaux à partir d'images 2D, mais LMD les isole en 3D. Ainsi, les échantillons sondent également la relocalisation des protéines axée sur la morphologie autour du noyau, comme illustré par les noyaux de classe 6. De même, l'excision des noyaux capture dans une certaine mesure le trafic de protéines vers et depuis le cytosol.

Ces expériences de culture cellulaire établissent que le DVP corrèle les phénotypes cellulaires, l'hétérogénéité et la dynamique avec le niveau de protéome de manière impartiale pour les phénotypes communs et rares.

Des milliards d'échantillons de patients sont collectés régulièrement lors des bilans diagnostiques et stockés dans les archives des services de pathologie du monde entier23. La caractérisation protéomique précise de cellules individuelles dans leur contexte spatial et subcellulaire à partir de lames de tissus pourrait avoir un effet clinique considérable, complétant le domaine émergent de la pathologie numérique24. Nous avons sélectionné des tissus archivés inclus en paraffine d'un carcinome à cellules acineuses des glandes salivaires, une tumeur maligne rare et sous-étudiée des cellules sécrétoires épithéliales de la glande salivaire. Nous avons développé un protocole de coloration immunohistochimique (IHC) sur des lames de membrane de verre pour LMD et coloré le tissu pour EpCAM afin de définir les limites cellulaires pour la segmentation et l'extraction de caractéristiques par BIAS (méthodes). Ces régions d'aspect histologiquement normal étaient principalement composées de cellules acineuses, canalaires et myoépithéliales, tandis que le composant de carcinome avait des cellules tumorales principalement uniformes avec des noyaux ronds et un cytoplasme basophile abondant (Fig. 4a, b).

a, coloration IHC d'un carcinome à cellules acineuses de la glande salivaire à l'aide de la protéine d'adhésion cellulaire EpCAM. b, régions représentatives de tissus d'apparence normale (panneaux supérieurs I et II) et de carcinome à cellules acineuses (panneaux inférieurs III et IV) de a. c, flux de travail DVP appliqué au tissu de carcinome à cellules acineuses. Détection de cellule unique basée sur DL de cellules d'apparence normale (vert) et néoplasiques (magenta) positives pour EpCAM. Classification cellulaire basée sur les caractéristiques phénotypiques (facteur de forme, surface, solidité, périmètre et intensité EpCAM). d, Corrélations protéomiques des répliques provenant de régions d'apparence normale (normal, n = 6) ou cancéreuses (cancer, n = 9). e, Volcano plot de comparaison protéomique par paires entre les tissus normaux et cancéreux. les protéines significatives du test t (test t bilatéral, FDR < 0,05, s0 = 0,1, n = 6 répliques biologiques pour la normale et n = 9 pour le cancer) sont mises en évidence par des lignes noires. Les protéines plus fortement exprimées dans les tissus normaux sont surlignées en vert sur la gauche du volcan, y compris les marqueurs cellulaires aciniques connus (AMY1A, CA6 et PIP). Les protéines plus fortement exprimées dans le carcinome à cellules acineuses sont à droite en magenta, y compris le proto-oncogène SRC et les protéines de réponse à l'interféron (MX1 et HLA-A; tableau supplémentaire 6). f, validation IHC des résultats protéomiques. CNN1, SRC, CK5 et FASN sont significativement enrichis en tissu normal ou cancéreux. Barre d'échelle, 100 μm.

Pour identifier les signatures protéiques spécifiques à la maladie, nous avons cherché à comparer les cellules acineuses histologiquement normales avec les cellules malignes plutôt que de les mélanger avec des proportions variables de cellules non apparentées. À cette fin, nous avons classé les cellules acineuses et canalaires du tissu normal de la glande parotide en fonction de leurs caractéristiques morphologiques spécifiques au type de cellule et des classes unicellulaires isolées pour l'analyse protéomique (Fig. 4c et Extended Data Fig. 4a). L'analyse bioinformatique des différences protéomiques mesurées a révélé des différences biologiques significatives entre ces types de cellules voisines, reflétant leurs fonctions physiologiques distinctes. Les cellules acineuses, qui produisent et sécrètent de la salive dans des granules sécrétoires, ont montré une expression élevée de protéines liées au transport et à la glycosylation des vésicules, ainsi que des marqueurs de cellules acineuses connus tels que l'α-amylase (AMY1A), CA6 et PIP (Extended Data Fig. 4b). En revanche, les cellules canalaires exprimaient des niveaux élevés de mitochondries et de protéines liées au métabolisme nécessaires pour répondre à la forte demande énergétique pour la sécrétion de salive25 (données étendues Fig. 4c et tableau supplémentaire 5). À titre de comparaison, nous avons exclusivement excisé les cellules acineuses malignes et bénignes des différentes régions d'une même section de tissu. Les protéomes des cellules acineuses se sont regroupés quel que soit l'état de la maladie, indiquant une forte signature de cellule d'origine (Extended Data Fig. 4d). L'analyse de six répliques d'apparence normale et de neuf régions néoplasiques a montré une excellente corrélation du protéome au sein du groupe (Pearson r > 0,96). La corrélation plus faible entre les cellules normales et les cellules cancéreuses reflétait des modifications du protéome spécifiques à la maladie et au type de cellule (Pearson r = 0, 8; Fig. 4d, e et tableau supplémentaire 6). Les marqueurs de cellules acineuses dans le carcinome étaient significativement régulés à la baisse, conformément aux rapports précédents25. Le DVP nous a permis de découvrir la régulation à la hausse des protéines de réponse à l'interféron (par exemple, MX1 et HLA-A; tableau supplémentaire 6) et du proto-oncogène SRC, deux cibles thérapeutiques exploitables26 (Fig. 4e). Nous avons validé les résultats protéomiques à l'aide de l'analyse IHC de protéines considérablement enrichies dans des tissus d'apparence normale ou cancéreuses. Cela a abouti à la sélection de CNN1, SRC, CK5 et FASN (Fig. 4f), ce qui a confirmé nos résultats protéomiques, démontré l'absence de contamination et soutenu la spécificité de notre approche DVP.

Le décodage des altérations moléculaires dans le développement et la progression du mélanome est essentiel pour identifier les vulnérabilités thérapeutiques dans cette maladie hautement métastatique. Les mutations pathogènes du mélanome étant largement cataloguées27,28,29, nous avons entrepris d'étudier directement les protéomes spatialement résolus de phénotypes cellulaires distincts de la progression du mélanome (Fig. 5a, b et Extended Data Fig. 5a, b). Nous avons co-coloré du matériel tumoral primaire inclus dans le FFPE et conservé pendant 17 ans avec deux marqueurs, SOX10 et CD146, pour cartographier les cellules de mélanome. Comme la surexpression de CD146 est impliquée dans la progression du mélanome et que l'immunothérapie contre le CD146 cible les métastases30, nous avons utilisé le CD146 comme marqueur de progression de la maladie dans notre analyse. ML a prédit cinq classes avec une distribution spatiale clairement définie : classe 1, mélanome in situ ; classe 2, à prédominance tumorale ; classe 3, cellules du microenvironnement tumoral ; classe 4, enrichie en régions CD146-high ; et la classe 5, enrichie en régions CD146-low. Nous avons utilisé l'imagerie à haut contenu pour déterminer le nombre requis de cellules pour identifier des phénotypes cellulaires statistiquement et analytiquement robustes pour un type de cellule précis et un isolement d'état dans une région spatiale. Pour cette raison, nous avons généralement collecté environ 100 cellules par échantillon (Méthodes). Y compris les réplicats, nous avons isolé et profilé 27 échantillons différents obtenus à partir de sept régions uniques de la même section de tissu, y compris les mélanocytes normaux, le mélanome in situ et le mélanome primaire des phases de croissance radiale et verticale (Fig. 5a – d). Nous avons trouvé une reproductibilité quantitative élevée parmi les réplicats biologiques, entraînant des protéomes spécifiques à l'état de la maladie et à la région (Fig. 5e – g). Le mélanome précancéreux (mélanome in situ) et le mélanome primaire ont montré des différences dans les protéines impliquées dans la signalisation des cellules immunitaires et le métabolisme cellulaire et ont coïncidé avec une mélanogenèse réduite (tableau supplémentaire 7 et données étendues Fig. 5d). Les stades avancés (phase de croissance radiale et verticale du mélanome) ont montré une activation bien définie de l'activation métabolique ainsi que la progression de la maladie, une caractéristique connue des cancers humains31. L'expression des protéines impliquées dans la phosphorylation oxydative et la fonction des mitochondries a progressivement augmenté des mélanocytes, du mélanome in situ au mélanome invasif, indiquant une dépendance à la respiration mitochondriale aux stades avancés de la tumeur (Fig. 5h – j, Données étendues Fig. 5c et Tableaux supplémentaires 7– 9). Inversement, les protéines impliquées dans la présentation de l'antigène et la réponse à l'interféron ont été régulées à la baisse par rapport au mélanome in situ (Fig. 5h – j et tableaux supplémentaires 7 à 9), conformément aux stratégies d'évasion immunitaire dans le mélanome32.

a, flux de travail d'isolement d'échantillon DVP pour profiler le mélanome primaire. b, DVP appliqué au mélanome primaire coloré immunohistochimiquement pour le marqueur mélanocytaire SOX10 et le marqueur mélanome CD146. Panneau de gauche : tissu de mélanome coloré sur une lame de membrane de verre PEN. Panneau de droite : annotation guidée par la pathologie de différentes régions tissulaires. Barre d'échelle, 1 mm. c, classification cellulaire guidée par un pathologiste et basée sur ML basée sur l'intensité de la coloration CD146 et SOX10 et la localisation spatiale : mélanocytes normaux, cellules stromales, mélanome in situ, mélanome CD146 bas, mélanome CD146 haut, mélanome à croissance radiale et mélanome à croissance verticale. Panneau inférieur droit : fréquence des classes prédite par ML non supervisé (k-means clustering). d, Exemples d'images des sept classes identifiées. Facteur de grossissement = ×4 400. e, Matrice de corrélation (Pearson r) des 27 échantillons de protéome mesurés. f, PCA des protéomes. g, PCA de tous les protéomes spécifiques du mélanome, du mélanome in situ au mélanome invasif (croissance verticale). h, Regroupement hiérarchique non supervisé basé sur les 1 910 groupes de protéines significatifs ANOVA (FDR < 0,05). Deux groupes de protéines régulées à la hausse (groupe A) ou à la baisse (groupe B) dans le mélanome invasif sont mis en évidence. i, Carte thermique des tissus cartographiant les résultats de la protéomique sur les données d'imagerie. Les niveaux de parcours relatifs des termes sélectionnés dans les deux groupes sont mis en évidence dans i. Les niveaux médians de protéines ont été calculés par annotation et tracés pour chaque classe de cellules isolées par rapport à leurs coordonnées x et y, telles que définies par leurs contours cellulaires segmentés. j, diagrammes en boîte des niveaux de protéines notés en z pour les voies régulées de manière différentielle visualisées en i ci-dessus. Les boîtes à moustaches définissent la plage des données (moustaches), les 25e et 75e centiles (boîte) et les médianes (ligne continue). Les valeurs aberrantes sont tracées sous forme de points individuels à l'extérieur des moustaches. k, Comparaison des changements protéomiques dans les cellules de mélanome CD146-high (classe 4) de la croissance verticale (région 2) avec la croissance radiale (région 1). Les vaisseaux sanguins à proximité des cellules de mélanome de la croissance verticale sont surlignés en rouge. Barre d'échelle, 1 mm. l, graphique d'analyse d'enrichissement d'ensemble de gènes de voies significativement enrichies pour les cellules de mélanome de la phase de croissance verticale et radiale.L'analyse d'enrichissement des voies était basée sur le changement de pli protéique entre les cellules de mélanome verticales et radiales et réalisée avec le package ClusterProfiler R36. Les termes enrichis avec un FDR < 0,05 sont affichés. CMH, complexe majeur d'histocompatibilité.

La progression du mélanome est un processus par étapes impliquant des phases de croissance radiale et verticale. La comparaison directe de ces régions définies dans l'espace du même phénotype (cellules de classe 4) a en outre mis en évidence des caractéristiques essentielles des métastases cancéreuses, telles que le remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) (par exemple, la dégradation du collagène) et la signalisation PDGF régulée33 (Fig. 5k, l , données étendues Fig. 5e et tableau supplémentaire 10). Ces changements induits par la tumeur favorisent la croissance, augmentent la migration des cellules tumorales et remodelent l'ECM pour faciliter la métastase vers des organes distants via les vaisseaux sanguins adjacents33. DVP a également découvert une régulation à la hausse significative de l'épissage de l'ARNm dans la phase verticale par rapport à la phase de croissance radiale. L'épissage alternatif pro-oncogène est devenu récemment une stratégie thérapeutique en oncologie34, et ces tumeurs présentent souvent des néo-antigènes immunogènes35. L'augmentation de l'épissage a coïncidé avec une régulation négative significative de la signalisation liée au système immunitaire (signalisation de l'interféron et présentation de l'antigène) (Fig. 5l et tableau supplémentaire 10), suggérant la transition d'une zone tumorale «chaude» immunogène à une zone tumorale «froide» dans le vertical phase de croissance au sein d'une même section tumorale. De toute évidence, le DVP a résolu spatialement l'hétérogénéité tumorale en localisant l'épissage de l'ARNm lié à la tumeur, les réponses immunitaires et les voies de remodelage de la MEC dans différentes régions.

DVP combine des technologies d'imagerie avec une protéomique impartiale pour quantifier le nombre de protéines exprimées dans une cellule donnée, cartographier des protéomes spécifiques à un tissu ou à un type de cellule ou pour identifier des cibles pour de futurs médicaments et diagnostics. Nous avons montré comment nos analyses décrivent un riche « microcosme dans une diapositive », révélant des voies clés dérégulées dans la progression du cancer et étendant efficacement la « pathologie numérique » par une dimension moléculaire. Il est largement applicable à tout système biologique qui peut être imagé au microscope, de la culture cellulaire à la pathologie. Comme une seule lame peut englober des centaines de milliers de cellules, DVP peut découvrir et caractériser des états et des interactions cellulaires rares. Contrairement à la transcriptomique unicellulaire, le DVP peut facilement analyser les structures subcellulaires et la dynamique spatiale de l'ECM. Avec de nouvelles améliorations dans la technologie protéomique, le DVP devrait également être adapté pour étudier les protéoformes et les modifications post-traductionnelles au niveau d'une seule cellule.

Nous avons recueilli des échantillons de tissus FFPE d'archives de carcinome à cellules acineuses des glandes salivaires et de mélanome du Département de pathologie, Hôpital universitaire de Zealand, à Roskilde, au Danemark. Le tissu de mélanome provenait d'un homme de 51 ans et était situé dans la partie supérieure gauche de la poitrine. Le stade TNM au moment du diagnostic était T3aN1M0. Le sous-type histologique était un mélanome superficiel à extension ; le niveau de Clark était de 4 ; et l'épaisseur de Breslow était de 2,27 mm. L'infiltration immunitaire tumorale a été classée comme non rapide. L'échantillon FFPE avait 17 ans. Le patient a présenté une récidive à différents endroits 17 mois après le diagnostic et est décédé après 71 mois. Le carcinome à cellules acineuses a été retiré de la glande parotide droite d'un homme de 29 ans. Il n'y avait aucun signe de mitose, de dédifférenciation par nécrose ou de croissance périneurale ou intravasculaire. Les cellules tumorales étaient positives en EpCAM, CK7, DOG1 et SOX10. La mammaglobine était négative. L'échantillon avait 4 ans et le patient est actuellement en bonne santé. L'étude a été réalisée conformément aux directives institutionnelles approuvées par le comité local d'examen de l'éthique médicale (SJ-742) et l'Agence de protection des données (REG-066-2019) et en accord avec la loi danoise (loi sur la recherche médicale impliquant des sujets humains) . Le tissu des trompes de Fallope illustré à la Fig. 2 provient d'une femme de 64 ans et était macroscopiquement et histologiquement normal. Tous les patients ont consenti avant l'intervention. Des tissus provenant de patients ont été obtenus frais ou inclus en paraffine selon un protocole approuvé par un comité d'examen institutionnel (13372B) à l'hôpital de l'Université de Chicago. Conformément à l'approbation du comité d'éthique médicale, tous les échantillons de tissus de patients humains FFPE ont été exemptés de consentement, car ces études utilisaient des échantillons pathologiques archivés existants. Des échantillons de tissus humains ont été évalués par un pathologiste certifié par le conseil.

La lignée cellulaire d'ostéosarcome humain U2OS a été cultivée dans du DMEM (glycémie élevée, GlutaMAX) contenant 10 % de FBS et de la pénicilline-streptomycine (Thermo Fisher Scientific).

Les cellules U2OS FUCCI ont été gracieusement fournies par Atsushi Miyawaki14. Ces cellules sont étiquetées de manière endogène avec deux protéines fluorescentes fusionnées aux régulateurs du cycle cellulaire CDT1 (mKO2-hCdt1+) et à la géminine (mAG-hGem+). CDT1 s'accumule pendant la phase G1, tandis que la géminine s'accumule dans les phases S et G2, permettant le suivi du cycle cellulaire. Les cellules ont été cultivées à 37 ° C dans un environnement humidifié à 5, 0% de CO2 dans le supplément GlutaMAX de milieu 5A (modifié) de McCoy (Thermo Fisher Scientific, 36600021) additionné de 10% de FBS (VWR) sans antibiotiques.

Des cellules U2OS exprimant de manière stable une forme d'eGFP ciblée sur la membrane ont été générées par transfection avec le plasmide Lck-GFP (Addgene, 61099 (réf. 37)) et cultivées dans un milieu de sélection (milieu DMEM contenant 10% de FBS, pénicilline-streptomycine et 400 μg ml -1 de Généticine) dans des conditions de dilution limitée pour donner des colonies uniques. Une lignée cellulaire clonale avec des niveaux d'expression homogènes et modérés de Lck-eGFP au niveau de la membrane plasmique a été établie à partir d'une seule colonie.

Toutes les lignées cellulaires ont été testées pour les mycoplasmes (MycoAlert, Lonza) et authentifiées par profilage STR (IdentiCell).

Les lames à membrane PEN 1.0 (Zeiss, 415190-9041-000) ont été traitées avec de la lumière UV pendant 1 heure et recouvertes d'APES (3-aminopropyltriéthoxysilane) en utilisant le réactif VECTABOND (Vector Labs, SP-1800-7) selon le protocole du fabricant. Des coupes de tissu FFPE ont été coupées (2,5 µm), séchées à l'air à 37 ° C pendant une nuit et chauffées à 60 ° C pendant 20 minutes pour faciliter une meilleure adhérence des tissus. Ensuite, les coupes ont été déparaffinées, réhydratées et chargées humides sur l'instrument entièrement automatisé Omnis (Dako). La récupération de l'antigène a été effectuée à l'aide d'une solution de récupération cible pH 9 (Dako, S2367) diluée à 1:10 et chauffée pendant 60 minutes à 90 °C. Coloration simple pour EpCAM (Nordic BioSite, clone BS14, BSH-7402-1, dilution 1:400) et double coloration séquentielle pour SOX10/CD146 (SOX10, Nordic BioSite, clone BS7, BSH-7959-1, dilution 1:200 ; CD146, Cell Marque, clone EP54, AC-0052, dilution 1:400) a été réalisé et les lames ont été incubées pendant 30 minutes (32 °C). Après lavage et blocage de l'activité peroxydase endogène, les réactions ont été détectées et visualisées à l'aide du kit EnVision FLEX, High pH (Dako, GV800 et GV809/GV821) selon les instructions du fabricant. Dans la double coloration, les systèmes chromogènes de substrat EnVision DAB (Dako, GV825) et EnVision Magenta (Dako, GV900) ont été utilisés pour la visualisation de CD146 et SOX10, respectivement. Enfin, les lames ont été rincées à l'eau, contre-colorées avec de l'hématoxyline de Mayer et séchées à l'air sans montage.

Des coupes de tissu FFPE ont été coupées (2,5 µm), placées sur des lames enduites (Agilent/Dako, K8020) et séchées à l'air verticalement avant d'être chauffées à 60 °C pendant 20 minutes pour faciliter l'adhérence des tissus. Ensuite, les lames ont été chargées sur l'instrument entièrement automatisé Omnis. Les coupes ont été déparaffinées et la récupération de l'antigène a été effectuée à l'aide d'une solution de récupération de cible à pH élevé (Agilent/Dako, GV804, diluée à 1 : 50) à 97 °C pendant 24 minutes. Ensuite, les coupes ont été incubées avec les anticorps primaires. Nous avons sélectionné des anticorps évalués et approuvés par un pathologiste consultant certifié. Proto-oncogene tyrosine protein kinase SRC/c-Src (Cell Signaling Technology, clone 36D10, 2109, dilution 1:3,200), acide gras synthase/FASN (Cell Signaling Technology, clone C20G5, 3180, dilution 1:100), calponine- 1/CNN1 (Cell Marque, clone EP63, AC-0060, dilution 1:300) et cytokératine 5/CK5 (Leica Biosystems, clone XM26, NCL-L-CK5, dilution 1:200) pendant 30 minutes à 32°C. Après lavage et blocage de l'activité peroxydase endogène, les réactions ont été détectées et visualisées à l'aide du kit EnVision FLEX, High pH (Agilent/Dako, GV800 et GV809/GV821) selon les instructions du fabricant. Enfin, les lames ont été rincées à l'eau, contre-colorées avec de l'hématoxyline de Mayer et recouvertes d'une lamelle.

Les cellules ont d'abord été incubées avec de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) pendant 20 minutes, puis fixées pendant 5 minutes à température ambiante avec du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et lavées trois fois avec du PBS. Les cellules ont ensuite été perméabilisées avec du PBS/0,2 % de Triton X-100 pendant 2 minutes sur de la glace et lavées trois fois avec du PBS. Les cellules ont ensuite été colorées avec un kit de marquage EdU (Life Technologies) et contre-colorées avec Hoechst 33342 pendant 10 minutes. Les diapositives ont été montées avec une monture GB (GBI Labs, E01-18).

Pour les expériences de validation (Extended Data Fig. 3), des plaques à fond de verre à 96 puits (Greiner SensoPlate Plus, Greiner Bio-One) ont été recouvertes de 12,5 µg ml-1 de fibronectine humaine (Sigma-Aldrich) pendant 1 heure à température ambiante. . L'immunocytochimie a été réalisée selon un protocole établi38. Ensuite, 8 000 cellules U2OS ont été ensemencées dans chaque puits et incubées dans un environnement à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 heures. Les cellules ont été lavées avec du PBS, fixées avec 40 µl de PFA glacé à 4 % et perméabilisées avec 40 µl de 0,1 Triton X-100 dans du PBS pendant 3 x 5 minutes. Des anticorps HPA polyclonaux de lapin ciblant les protéines d'intérêt ont été dilués dans un tampon de blocage (PBS + 4% FBS) à 2–4 µg ml-1 avec des anticorps marqueurs primaires (voir ci-dessous) et incubés pendant une nuit à 4 ° C. Les cellules ont été lavées avec du PBS pendant 4 x 10 minutes et incubées avec des anticorps secondaires (chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488 (A11034, Thermo Fisher Scientific), chèvre anti-souris Alexa Fluor 555 (A21424, Thermo Fisher Scientific) et chèvre anti-poulet Alexa Fluor 647 (A21449, Thermo Fisher Scientific)) dans un tampon de blocage à 1,25 µg ml-1 pendant 90 minutes à température ambiante. Les cellules ont été contre-colorées dans 0,05 µg ml-1 de DAPI pendant 15 minutes, lavées avec pendant 4 x 10 minutes et montées dans du PBS.

Les anticorps primaires utilisés étaient les suivants :

Pour la validation du cycle cellulaire C7orf50 : anti-ANLN de souris à 1,25 µg ml−1 (amab90662, Atlas Antibodies)

Anti CCNB1 de souris à 1 µg ml−1 (610220, BD Biosciences)

Anti-C7orf50 de lapin à 1 µg ml−1 (HPA052281, Atlas Antibodies)

Pour le tissu des trompes de Fallope humaines, des coupes de tissu FFPE (2,5 µm) ont été montées et prétraitées comme décrit ci-dessus. Ensuite, le tissu a été déparaffiné en lavant 2 x 2 minutes dans du xylène à 100 %, suivi d'une série d'éthanol à 100 %, 95 % et 70 % pendant 1 minute, respectivement, et 3 x 1 minute dans ddH2O. La récupération de l'antigène a été effectuée dans un bain-marie en utilisant un tampon de récupération EDTA (EDTA 1 mM, 0,05 % de Tween 20, pH 8,0) à 95 °C pendant 1 heure. Après une phase de refroidissement de 1 heure à température ambiante, le blocage a été réalisé avec du sérum de chèvre à 10 % dans du TBST pendant 1 heure à température ambiante. Les anticorps primaires ciblant FOXJ1 (souris, dilution 1:200, 14-9965-80, Invitrogen) et EpCAM (lapin, dilution 1:200, 14452, Cell Signaling Technology) ont été dilués dans du sérum de chèvre à 10 % et incubés pendant une nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée. Les échantillons de tissus ont été lavés 5 fois dans du TBST et des anticorps secondaires pour la visualisation de FOXJ1 (Alexa Fluor 647 chèvre anti-souris, dilution 1:200, A21235, Invitrogen) et EpCAM (Alexa Fluor 555 chèvre anti-lapin, dilution 1:200, A21428, Invitrogen) et SYTO 10 pour la visualisation nucléaire (10624243, Invitrogen) a été appliqué pendant 1 heure à température ambiante dans l'obscurité. Les échantillons ont été lavés 5 fois dans du TBST, suivis de 2 fois dans du TBS et recouverts d'une lamelle pour une imagerie à haute teneur.

Des images de cultures cellulaires marquées par immunofluorescence ont été acquises à l'aide d'un microscope AxioImager Z.2 (Zeiss), équipé d'une optique grand champ, d'un objectif sec ×20, 0,8 NA et d'un ensemble de filtres à quatre bandes pour Hoechst, FITC, Cy3 et Cy5 colorants fluorescents. L'acquisition à champ large a été réalisée à l'aide de la source de lumière LED Colibri 7 et d'une caméra mono AxioCam 702 avec 5,86 μm par pixel. Des piles Z avec 19 tranches z ont été acquises par incréments de 3 mm pour capturer le plan de mise au point optimal. Les images ont été obtenues automatiquement avec Zeiss ZEN 2.6 (édition bleue) dans des conditions non saturantes (plage dynamique 12 bits).

Les images IHC des glandes salivaires et des tissus de mélanome ont été obtenues à l'aide du scanner de diapositives automatisé Zeiss Axio Scan.Z1 pour la microscopie à fond clair. L'acquisition en fond clair a été obtenue à l'aide de la source lumineuse VIS LED et d'une caméra CCD Hitachi HV-F202CLS. Les diapositives PEN ont été numérisées avec un objectif sec × 20, 0, 8 NA donnant une résolution de 0, 22 mm par pixel. Des piles Z avec huit tranches z ont été acquises par incréments de 2 mm pour capturer le plan de mise au point optimal. Les images couleur ont été obtenues automatiquement avec Zeiss ZEN 2.6 (édition bleue) dans des conditions non saturantes (plage dynamique 12 bits).

Les cellules ont été imagées sur un microscope à grand champ Leica Dmi8 équipé d'un objectif à air 0, 8 NA, × 40 et d'une caméra Hamamatsu Flash 4.0 V3 utilisant le logiciel LAS X. La segmentation de chaque cellule a été réalisée à l'aide du logiciel Cell Profiler8 en utilisant DAPI pour la segmentation des noyaux. L'intensité moyenne de la protéine cible et de la protéine marqueur du cycle cellulaire a été mesurée dans le noyau. Les cellules ont été regroupées dans les phases G1 et G2 du cycle cellulaire en utilisant le quantile 0,2 et 0,8 des niveaux d'intensité ANLN ou CCNB1 dans le noyau, et l'expression dépendante du cycle cellulaire de C7orf50 a été validée en comparant les différences de niveaux d'expression entre G1 et les cellules G2.

Pour exciser des cellules ou des noyaux, nous avons utilisé le système Leica LMD7, que nous avons adapté pour l'automatisation automatisée d'une seule cellule. Une précision de coupe élevée a été obtenue à l'aide d'un objectif HC PL FLUOTAR L ×63/0,70 (tissu) ou ×40/0,60 (cultures cellulaires) CORR XT. Nous avons utilisé le logiciel Leica Laser Microdissection V 8.2.3.7603 (adapté pour ce projet) pour l'excision entièrement automatisée et la collecte des contours. Pour l'analyse du protéome tissulaire FFPE, nous avons collecté 50 à 100 cellules par échantillon (surface totale collectée × épaisseur de la lame / volume moyen de cellules de mammifères de 2 000 µm3 ; BNID 100434), en accord avec les estimations de l'analyse transcriptomique spatiale39.

Précision de coupe Leica LMD7 (Leica R&D, brevet EP1276586)

Pour objectif ×150 : \({\frac{10}{150}} = 0,07\,\upmu{\mathrm{m}}\)

Les modèles nucleAIzer3 ont été intégrés dans BIAS et personnalisés pour ces expériences en recyclant et en affinant les modèles de segmentation du noyau et du cytoplasme. Tout d'abord, l'apprentissage par transfert de style5 a été effectué comme suit. Étant donné un nouveau scénario expérimental tel que nos sections de mélanome ou de tissu de glande salivaire colorées par immunohistochimie, dont l'acquisition produit un type d'image tel qu'aucune donnée de formation annotée n'existe pour, empêchant une segmentation efficace avec des méthodes DL même puissantes. Avec une segmentation initiale ou un contourage manuel par des experts (appelé annotation), un petit ensemble de données de masque est acquis (les masques représentent, par exemple, des noyaux), qui est utilisé pour générer de nouvelles images de masque (synthétiques) telles que la distribution spatiale, la densité et les propriétés morphologiques des objets générés (par exemple, les noyaux) sont similaires à celles mesurées sur les images annotées. Les masques initiaux et leurs images de microscopie correspondantes sont utilisés pour former un modèle de transfert de style d'image qui apprend à générer la texture des images de microscopie sur les masques, en marquant des objets à l'aide de GANs40 (réseaux antagonistes génératifs) : premier plan pour imiter, par exemple, des noyaux , et fond pour entourer, par exemple, les structures tissulaires. Parallèlement, des masques artificiels d'objets de noyau ou de cytoplasme ont été créés et entrés dans le réseau d'apprentissage par transfert de style d'image qui a généré des images de microscopie synthétique d'apparence réaliste avec l'apparence visuelle de l'expérience originale. Par conséquent, avec ces données d'entraînement créées artificiellement (images de microscopie synthétiques et leurs masques correspondants, également synthétiques), leur modèle de segmentation appliqué, Mask R-CNN, est préparé pour le nouveau type d'image et peut segmenter avec précision les compartiments cibles.

Nous avons évalué la précision de l'approche de segmentation sur une lignée cellulaire fluorescente Lck-U2OS ainsi que sur des échantillons de tissus de mélanome, de glande salivaire et de trompe de Fallope et avons comparé les résultats à trois méthodes supplémentaires, dont deux approches DL - unet4nuclei (notées M1 sur la Fig. 2a et S1)6 et Cellpose (M3)7—aux côtés d'une application conventionnelle basée sur un seuil adaptatif et basée sur le fractionnement d'objet (M2)8, largement utilisée. Nous notons que M1 n'est pas destiné à la segmentation du cytoplasme (voir les détails dans la réf. 6 et ci-dessous). La précision de la segmentation selon la métrique F1 est affichée sous forme de diagrammes à barres (Fig. 2b, Données étendues Fig. 1a, Tableau 1 et Tableau supplémentaire 1), et une représentation visuelle avec un code couleur est également fournie.

unet4nuclei6 est optimisé pour segmenter les noyaux sur des images de culture cellulaire ; Cellpose7 est une approche destinée à la segmentation du noyau ou du cytoplasme sur divers types d'images de microscopie ; et CellProfiler8 est un logiciel classique basé sur un seuil et basé sur le fractionnement d'objets largement utilisé dans la communauté d'analyse de bioimages. unet4nuclei, comme son nom l'indique, est principalement destiné à la segmentation du noyau et utilise un réseau basé sur U-Net après prétraitement des images d'entrée, puis post-traitement des objets détectés. Cellpose utilise une représentation vectorielle des flux d'instances, et son réseau neuronal (également basé sur U-Net) prédit et combine les flux horizontaux et verticaux. unet4nuclei a été appliqué avec succès dans la segmentation du noyau des cultures cellulaires, tandis que Cellpose est capable de bien généraliser sur diverses modalités d'image même en dehors de la microscopie et peut être utilisé pour segmenter les noyaux et les cytoplasmes. Cependant, comme la plupart des méthodes de segmentation, aucune n'est capable de s'adapter à un nouveau domaine d'image, tel qu'un type d'expérience particulier (par exemple, le tissu des glandes salivaires IHC), sans se recycler sur les annotations de vérité au sol nouvellement créées. Au contraire, notre algorithme de segmentation (nucleAIzer3) est capable de le faire via l'approche de transfert de style d'image mentionnée ci-dessus. Évidemment, les algorithmes conventionnels ne peuvent pas non plus s'adapter ; ainsi, ils doivent être reparamétrés pour chaque expérience. Pour l'évaluation, un utilisateur expert de CellProfiler a été invité à optimiser un pipeline pour chaque type d'échantillon afin d'obtenir le meilleur résultat de segmentation possible, puis toutes les images par type d'échantillon ont été segmentées avec un pipeline (correspondant à l'échantillon donné).

Nous avons évalué nos performances de segmentation (et nos comparaisons) en fonction de la métrique du score F1 calculée au seuil de 0,7-IoU (intersection sur union). IoU, également connu sous le nom d'indice de Jaccard, a été calculé à partir de la région de chevauchement de l'objet prédit (segmenté) avec son objet de vérité terrain (réel) correspondant à un seuil donné (voir la formulation ci-dessous). Les objets vrais positifs (TP), faux positifs (FP) et faux négatifs (FN) ont été comptés en conséquence, s'ils avaient un IoU supérieur au seuil t (dans notre cas, 0,7), pour donner le score F1 à ce moment. seuil (voir formulation ci-dessous). L'évaluation de la segmentation a été effectuée sur 10 à 20 images sélectionnées au hasard, échantillonnées dans des régions visuellement distinctes pour chaque type d'échantillon (cellules U2OS et mélanome, tissus des glandes salivaires et des trompes de Fallope) pour montrer la robustesse, par rapport aux annotations de vérité terrain dessinées par des experts utilisant AnnotatorJ41. Nous avons inclus des images de toutes les régions pertinentes de chaque échantillon - par exemple, des cellules canalaires, des cellules acini, des cellules sans aucune coloration de la membrane et des lymphocytes - dans le tissu des glandes salivaires, et de la même manière pour les autres échantillons, afin d'assurer la robustesse. Les contours ou les contours de tous les objets visibles (noyau ou cytoplasme) ont été dessinés individuellement, puis exportés vers des images de masque dans le même format que la segmentation a produit (masques de segmentation d'instance avec des intensités de gris croissantes par objets). Les masques de vérité au sol ont été utilisés uniquement dans l'évaluation ; l'apprentissage par transfert de style d'image susmentionné a été formé sur des masques extraits automatiquement des nouvelles expériences. Compte tenu des scores F1 moyens mesurés, nous concluons que la méthode de segmentation basée sur DL3 disponible dans BIAS a produit des segmentations au niveau du noyau et du cytoplasme de meilleure qualité que les méthodes comparées (voir les résultats dans les Fig. 2a, b et Extended Data Fig. 1a).

Les résultats de notre évaluation de la segmentation du noyau et du corps cellulaire sur le mélanome, les tissus épithéliaux des glandes salivaires et des trompes de Fallope et les cellules U2OS sont présentés dans le tableau 1.

Ces résultats sont en corrélation avec notre étude précédente3 qui a montré des performances supérieures de nucleAIzer sur diverses modalités de données d'images de microscopie (culture cellulaire fluorescente, tissu d'hématoxyline et d'éosine et autres scénarios expérimentaux) par rapport à plusieurs approches de segmentation, y compris, par exemple, M2 et ilastik9.

Nous notons également que les méthodes précédentes, telles que CellProfiler ou ilastik, peuvent effectuer une segmentation précise des cellules ; de plus, les performances de M2 ​​sur la segmentation du noyau tissulaire sont remarquables. D'autre part, les méthodes robustes (par exemple, basées sur DL) offrent la commodité de ne pas avoir besoin de réinitialiser la plupart des paramètres lorsque vous travaillez sur des images d'un échantillon ou d'un type différent.

La culture cellulaire (noyaux ou cellules entières) et les échantillons de tissus ont été collectés par LMD automatisé dans des plaques à 384 puits (Eppendorf, 0030129547). Pour la collecte de différentes classes de noyaux U2OS (Fig. 3 et Extended Data Figs. 2 et 3), nous avons normalisé les différences de taille nucléaire (résultant en différentes quantités totales de protéines) par le nombre d'objets collectés par classe. En moyenne, nous avons collecté 267 noyaux par échantillon. Pour les échantillons de tissus FFPE de glande salivaire et de mélanome (sections de 2,5 µm d'épaisseur coupées avec un microtome), une surface de 80 000 à 160 000 µm2 par échantillon a été collectée pour un nombre estimé de 100 à 200 cellules sur la base du volume moyen de cellules HeLa de 2 000 μm3 (BNID 100434).

Ensuite, 20 ul de bicarbonate d'ammonium (ABC) ont été ajoutés à chaque puits d'échantillon, et la plaque a été fermée avec du ruban adhésif (Corning, CLS6569-100EA). Après vortex pendant 10 secondes, les plaques ont été centrifugées pendant 10 minutes à 2 000 g et chauffées à 95 °C pendant 30 minutes (culture cellulaire) ou 60 minutes (tissu) dans un thermocycleur (Bio-Rad S1000 avec module de réaction à 384 puits) à une température constante du couvercle de 110 °C. Ensuite, 5 µl de tampon de digestion 5x (acétonitrile à 60 % dans ABC 100 mM) ont été ajoutés et les échantillons ont été chauffés à 75 °C pendant 30 minutes supplémentaires. Les échantillons ont été rapidement refroidis et 1 µl de LysC a été ajouté (pré-dilué dans de l'eau ultra-pure à 4 ng µl-1) et digéré pendant 4 heures à 37 °C dans le thermocycleur. Par la suite, 1,5 µl de trypsine ont été ajoutés (pré-dilués dans de l'eau ultra-pure à 4 ng µl-1) et incubés pendant une nuit à 37 °C dans le thermocycleur. Le lendemain, la digestion a été arrêtée en ajoutant de l'acide trifluoroacétique (TFA, concentration finale 1 % v/v) et les échantillons ont été séchés sous vide (environ 1,5 heure à 60 °C). Ensuite, 4 µl de tampon de chargement MS (3 % d'acétonitrile dans 0,2 % de TFA) ont été ajoutés, et la plaque a été vortexée pendant 10 secondes et centrifugée pendant 5 minutes à 2 000 g. Les échantillons ont été stockés à -20 ° C jusqu'à l'analyse par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS).

Nous avons utilisé un fractionnement en phase inverse à pH élevé pour générer une bibliothèque de précurseurs cellulaires U2OS profonds pour une analyse MS indépendante des données (ci-dessous). Les peptides ont été fractionnés à pH 10 avec le spider-fractionator42. Ensuite, 30 μg de peptides purifiés ont été séparés sur une colonne C18 de 30 cm en 100 minutes et concaténés en 12 fractions avec des commutateurs de soupape de sortie de 90 secondes. Les fractions peptidiques ont été séchées sous vide et reconstituées dans un tampon de charge MS pour l'analyse LC – MS.

L'analyse LC-MS a été réalisée avec un système EASY-nLC-1200 (Thermo Fisher Scientific) connecté à un spectromètre de masse à temps de vol quadripolaire à spectrométrie de mobilité d'ions piégés modifié avec un courant ionique environ cinq fois plus élevé (timsTOF Pro, Bruker Daltonik ) avec une source d'ions nano-électrospray (CaptiveSpray, Bruker Daltonik). L'échantillonneur automatique a été configuré pour le prélèvement d'échantillons à partir de plaques à 384 puits.

Les peptides ont été chargés sur une colonne HPLC garnie en interne de 50 cm (diamètre intérieur de 75 µm garnie de billes de silice ReproSil-Pur C18-AQ de 1,9 µm, Dr Maisch).

Les peptides ont été séparés à l'aide d'un gradient linéaire à partir de 5 à 30 % de tampon B (0,1 % d'acide formique et 80 % d'ACN dans de l'eau de qualité LC-MS) en 55 minutes, suivi d'une augmentation à 60 % pendant 5 minutes et d'une période de 10 minutes. laver dans du tampon B à 95 % à 300 nl min-1. Le tampon A consistait en 0,1 % d'acide formique dans de l'eau de qualité LC-MS. La durée totale du gradient était de 70 minutes. Nous avons utilisé un four à colonne fabriqué en interne pour maintenir la température de la colonne constante à 60 °C.

L'analyse par spectrométrie de masse a été effectuée comme décrit dans Brunner et al., soit en mode dépendant des données (ddaPASEF) (Fig. 4) soit en mode indépendant des données (diaPASEF) (Figs. 2, 3 et 5). Pour ddaPASEF, une enquête MS1 TIMS-MS et dix scans PASEF MS/MS ont été acquis par cycle d'acquisition. L'accumulation d'ions et le temps de rampe dans l'analyseur TIMS double ont été réglés à 100 ms chacun, et nous avons analysé la plage de mobilité des ions de 1/K0 = 1,6 Vs cm-2 à 0,6 Vs cm-2. Les ions précurseurs pour l'analyse MS/MS ont été isolés avec une fenêtre 2-Th pour m/z < 700 et 3-Th pour m/z > 700 dans une plage m/z totale de 100 à 1 700 en synchronisant les événements de commutation quadripolaire avec le précurseur profil d'élution du dispositif TIMS. L'énergie de collision a été abaissée linéairement en fonction de l'augmentation de la mobilité à partir de 59 eV à 1/K0 = 1,6 Vs cm−2 jusqu'à 20 eV à 1/K0 = 0,6 Vs cm−2. Les ions précurseurs à charge unique ont été exclus avec un filtre polygonal (contrôle otof, Bruker Daltonik). Les précurseurs de MS/MS ont été sélectionnés à un seuil d'intensité de 1 000 unités arbitraires (au) et re-séquencés jusqu'à atteindre une « valeur cible » de 20 000 ua, en tenant compte d'une exclusion dynamique d'élution de 40 secondes. Pour une analyse indépendante des données, nous avons utilisé la corrélation de la mobilité ionique avec m/z et synchronisé l'élution des précurseurs de chaque balayage de mobilité ionique avec la fenêtre d'isolement quadripolaire. L'énergie de collision a augmenté linéairement en fonction de la mobilité des ions de 59 eV à 1/K0 = 1,6 Vs cm−2 à 20 eV à 1/K0 = 0,6 Vs cm−2. Nous avons utilisé la méthode ddaPASEF pour la génération de bibliothèque.

Les fichiers bruts de spectrométrie de masse acquis en mode ddaPASEF (Fig. 4) ont été analysés avec MaxQuant (version 1.6.7.0)43,44. La base de données UniProt (version 2019, UP000005640_9606) a été recherchée avec une correspondance spectrale peptidique et un FDR au niveau des protéines de 1 %. Un minimum de sept acides aminés était nécessaire, y compris l'acétylation N-terminale et l'oxydation de la méthionine en tant que modifications variables. En raison de l'omission de la réduction et de l'alkylation, la carbamidométhylation de la cystéine a été supprimée des modifications fixes. La spécificité enzymatique a été fixée à la trypsine avec un maximum de deux clivages manqués autorisés. La tolérance de masse de la première et de la recherche principale a été fixée à 70 ppm et 20 ppm, respectivement. Les identifications de peptides par MS/MS ont été transférées en faisant correspondre des modèles isotopiques quadridimensionnels entre les séries (MBR) avec une fenêtre de correspondance de temps de rétention de 0,7 minute et une fenêtre de mobilité ionique de 0,05 1/K0. La quantification sans étiquette a été réalisée avec l'algorithme MaxLFQ45 et un nombre de ratio minimum de 1.

Pour les mesures diaPASEF (Figs. 2, 3 et 5), les fichiers bruts ont été analysés avec DIA-NN46 (version 1.8). Pour générer une bibliothèque spectrale spécifique au projet, une bibliothèque de précurseurs fractionnés en phase inverse à pH élevé de 24 fractions a été créée à partir du même échantillon de tissu et acquise en mode ddaPASEF, comme décrit ci-dessus. Les fichiers bruts ont été analysés avec MSFragger47 sous les paramètres par défaut (à l'exception du fait que la carbamidométhylation de la cystéine a été supprimée des modifications fixes) pour générer le fichier de bibliothèque utilisé dans DIA-NN. La bibliothèque comprenait 90 056 précurseurs, 79 802 groupes d'élution et 7 765 groupes de protéines.

L'analyse des données protéomiques a été réalisée avec Perseus48 et dans l'environnement R (https://www.r-project.org/). Les tableaux de sortie MaxQuant ont été filtrés pour 'Inverse', 'Identifié uniquement par la modification du site' et 'Contaminants potentiels' avant l'analyse des données. Les données ont été rigoureusement filtrées pour conserver les protéines avec seulement 30 % ou moins de valeurs manquantes (celles affichées comme 0 dans la sortie MaxQuant). Les valeurs manquantes ont été imputées sur la base d'une distribution normale (largeur = 0,3 ; rétrogradation = 1,8) avant les tests statistiques. L'ACP a été réalisée en R. Pour les comparaisons multi-échantillons (ANOVA) ou protéomiques par paires (test t bilatéral non apparié), nous avons appliqué un FDR basé sur la permutation de 5 % pour corriger les tests d'hypothèses multiples. Une valeur s049 de 0,1 a été utilisée pour la comparaison protéomique par paires dans les Fig. 2h et 4e. L'analyse d'enrichissement des voies a été réalisée dans Perseus (tableaux supplémentaires 2, 3, 5 et 9 ; test exact de Fisher avec Benjamini-Hochberg FDR de 0,05) ou ClusterProfiler36 (tableaux supplémentaires 7 et 10), le package ReactomePA50 et la boîte à outils d'analyse d'ensembles de gènes WebGestalt ( WebGestaltR)51, avec un filtre FDR de 0,05, respectivement. La taille minimale de la catégorie a été définie sur 20 et la taille maximale sur 500.

Pour visualiser les résultats combinés de la microscopie et de la protéomique basée sur la SP, nous avons exporté les fichiers de données spatiales pour chaque classe prédite à partir du logiciel BIAS. Cette exportation génère des fichiers de sortie .xml avec la géométrie et l'emplacement des cellules dans une classe. Nous avons utilisé Python pour extraire ces informations et les agréger dans une trame de données. Nous avons ensuite tracé le centroïde (coordonnées x – y) de chaque cellule dans un nuage de points et superposé les données protéomiques. Pour visualiser les résultats fonctionnels des protéines dans un contexte spatial, nous avons effectué une analyse d'enrichissement de la voie REACTOME sur les résultats protéomiques générés et utilisé des scores d'enrichissement normalisés (z-scores) comme un dégradé de couleur reflétant la surreprésentation d'une voie donnée.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE52 avec l'identifiant de jeu de données PXD023904. Les données brutes BIAS, les données brutes d'image, un ensemble de données de démonstration et du matériel en ligne sur la façon d'installer BIAS et de reproduire notre travail sont accessibles sur la base de données BioStudies de l'Institut européen de bioinformatique53 (https://www.ebi.ac.uk/biostudies/) avec le numéro d'accès S-BSST820. Nous avons utilisé la base de données UniProt (version 2019, UP000005640_9606, https://www.uniprot.org) pour toutes les recherches de fichiers bruts par spectrométrie de masse.

Une version compilée gratuite de BIAS avec des capacités à haut débit limitées est disponible dans les archives BioStudies (numéro d'accès S-BSST820), contenant toutes les fonctionnalités appliquées dans les flux de travail décrits. Plusieurs composants majeurs de notre travail sont disponibles dans des référentiels open source (tableau supplémentaire 11).

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Szklarczyk, D. et al. STRING v11 : réseaux d'association protéine-protéine avec une couverture accrue, soutenant la découverte fonctionnelle dans des ensembles de données expérimentaux à l'échelle du génome. Nucleic Acids Res. 47, D607–D613 (2019).

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Les auteurs remercient M. Rykær, J. Madsen (NNF CPR Mass Spectrometry Platform, Université de Copenhague) et L. Drici (NNF CPR Proteomics Program) ainsi que J. Mueller (MPIB Munich) pour leur assistance technique. Nous remercions F. Hoffmann, C. Greb et F. Schlaudraff de Leica pour le support technique ; T. Danka et M. Kovács pour des discussions scientifiques fructueuses ; et T. Hartig Braunstein, P. Hernandez-Varas et C. Prats de l'installation centrale de microscopie intégrée pour le soutien de la microscopie. Nous remercions J. Lukas pour son soutien et ses conseils scientifiques et J. Percival pour les illustrations scientifiques (Illustration Ltd.). Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Novo Nordisk (accords de subvention NNF14CC0001 et NNF15CC0001) et de la Max Planck Society for the Advancement of Science et par l'Initiative Chan Zuckerberg pour le financement partiel des travaux sur le cycle cellulaire (subvention CZF2019-002448) à E Lundberg, MM et PH. FC reconnaît le programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne dans le cadre de la convention de subvention 846795 (subvention Marie Skłodowska-Curie) et le ministère allemand de l'Éducation et de la Recherche (BMBF), dans le cadre du nœud national de recherche « Spectrométrie de masse en médecine systémique » (MSCoreSys ), dans le cadre de la convention de subvention 161L0222. BDA reconnaît le soutien de la Fondation Lundbeck (R252-2017-1414) et de la Fondation Novo Nordisk (NNF20OC0065720). PH, RH, FK, EM et AK reconnaissent le soutien de la subvention LENDULET-BIOMAG (2018-342), des Fonds européens de développement régional (GINOP-2.2.1-15-2017-00072), H2020 (ERAPERMED-COMPASS, ERAPERMED-SYMMETRY , DiscovAIR, FAIR-CHARM), OTKA-SNN, TKP2021-EGA09 et ELKH-Excellence. E. Lengyel est soutenu par le NIH R35CA264619 et l'Initiative Chan Zuckerberg (CZIF2019-002435). Nous remercions S. Ito et H. Masai (Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science) pour avoir fourni la lignée cellulaire stable U2OS FUCCI. Le plasmide LCK-GFP était un cadeau de S. Green (Addgene, plasmide 61099).

Financement en libre accès fourni par Max Planck Society.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Andreas Mund, Fabian Coscia.

Programme de protéomique, Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, Faculté des sciences de la santé et de la médecine, Université de Copenhague, Copenhague, Danemark

Andreas Mund, Fabian Coscia, Alberto Santos, Beatrice Dyring-Andersen & Matthias Mann

Groupe de protéomique spatiale, Centre Max Delbrück de médecine moléculaire de l'Association Helmholtz, Berlin, Allemagne

Fabien Coscia

Unité de biologie synthétique et systémique, Centre de recherche biologique, Réseau de recherche Eötvös Loránd, Szeged, Hongrie

András Kriston, Réka Hollandi, Ferenc Kovács, Ede Migh & Peter Horvath

Single-Cell Technologies Ltd., Szeged, Hongrie

András Kriston, Ferenc Kovács & Peter Horvath

Protéomique et transduction du signal, Institut Max Planck de biochimie, Martinsried, Allemagne

Andreas-David Brunner, Lisa Schweizer & Matthias Mann

Centre for Health Data Science, Université de Copenhague, Copenhague, Danemark

Alberto Santos

Big Data Institute, Li-Ka Shing Centre for Health Information and Discovery, Université d'Oxford, Oxford, Royaume-Uni

Alberto Santos

Département de pathologie, Hôpital universitaire de Zealand, Roskilde, Danemark

Michael Bzorek, Soraya Naimy & Lise Mette Rahbek-Gjerdrum

Institut de médecine clinique, Université de Copenhague, Copenhague, Danemark

Lise Mette Rahbek-Gjerdrum

Département de dermatologie et d'allergie, Hôpital Herlev et Gentofte, Université de Copenhague, Hellerup, Danemark

Béatrice Dyring-Andersen

Leo Foundation Skin Immunology Research Center, Faculté des sciences de la santé et de la médecine, Université de Copenhague, Copenhague, Danemark

Béatrice Dyring-Andersen

Plate-forme d'imagerie des protéines, Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, Faculté des sciences de la santé et de la médecine, Université de Copenhague, Copenhague, Danemark

Jutta Bulkescher et Claudia Lukas

Programme de signalisation des protéines, Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, Faculté des sciences de la santé et de la médecine, Université de Copenhague, Copenhague, Danemark

Claudia Lucas

Département d'obstétrique et de gynécologie/Section d'oncologie gynécologique, Université de Chicago, Chicago, Illinois, États-Unis

Mark Adam Eckert et Ernst Pologne

Science for Life Laboratory, School of Engineering Sciences in Chemistry, Biotechnology and Health, KTH - Royal Institute of Technology, Stockholm, Suède

Christian Gnann et Emma Lundberg

Département de bioingénierie, Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Emma Lundberg

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, Californie, États-Unis

Emma Lundberg

Institut finlandais de médecine moléculaire (FIMM), Université d'Helsinki, Helsinki, Finlande

Pierre Horvath

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Conceptualisation : AMFC, PH et MM ; Méthodologie : AM, FC, ADB, MB, BDA et MM ; Logiciel : RH, FK, AK et PH ; Enquête : AM, FC et RH ; Analyse formelle : AM, FC et RH ; Rédaction—ébauche originale : AM, FC, PH et MM ; Rédaction — révision et édition : tous les auteurs ; Ressources : tous les auteurs. ; Conservation des données : LMRG, MB, SN, AM, FC, RH, FK, AK, AS, EM, LS, MAE, E. Lengyel et PH ; Visualisation : AM, FC, AS et RH ; Administration du projet : AM et PH ; Supervision : MM ; Acquisition de financement : FC, PH, E. Lundberg et MM

Correspondance à Andreas Mund, Peter Horvath ou Matthias Mann.

PH est le fondateur et actionnaire de Single-Cell Technologies Ltd., une société d'analyse de données biologiques qui possède et développe le logiciel BIAS. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Biotechnology remercie les évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, segmentation du corps cellulaire et des noyaux du mélanome, des glandes salivaires et des tissus des trompes de Fallope à l'aide du logiciel d'analyse d'images biologiques (BIAS). Nous avons évalué la précision de notre approche de segmentation à l'aide de la métrique F1 et comparé les résultats à trois méthodes supplémentaires M1-M3. unet4nuclei (M1)6, CellProfiler (M2)8, CellPose (M3)7, tandis que OUR fait référence à nucleAIzer3. Les barres montrent les scores F1 moyens avec SEM (erreur standard de la moyenne). Représentation visuelle des résultats de segmentation : les zones vertes correspondent aux vrais positifs, les bleues aux faux positifs et les rouges aux faux négatifs. Données fournies dans le tableau 1 et le tableau supplémentaire 1. b, BIAS permet le traitement de plusieurs formats de fichiers d'images de microscopie 2D et 3D. Exemples de prétraitement d'images, de segmentation d'images basée sur l'apprentissage en profondeur, d'extraction de caractéristiques et de classification de phénotype basée sur l'apprentissage automatique. c, Gauche : Alignement des contours dans le logiciel LMD7 avant la microdissection laser des cellules épithéliales des trompes de Fallope. Milieu : Capture d'écran après microdissection au laser. À droite : inspection de 384 puits après microdissection au laser dans des cellules épithéliales individuelles des trompes de Fallope. d, nombre de protéines quantifiées par réplicat de cellules épithéliales positives et négatives FOXJ1. Les échantillons ont été acquis en mode indépendant des données et analysés avec le logiciel DIA-NN. e, Répliquer les corrélations des mesures du protéome. Les valeurs de corrélation montrent les corrélations de Pearson. f, analyse de l'enrichissement des voies pour les protéines significativement plus élevées dans les cellules ciliées par rapport aux cellules épithéliales sécrétoires des trompes de Fallope.

a, Résultats protéomiques quantitatifs des répliques de cellules entières et de noyaux, et comparaison entre les cellules entières et les noyaux. b, Analyse en composantes principales (ACP) de la cellule entière (n = 3) et des protéomes des noyaux (n = 3). Les protéines avec la plus forte contribution à PC1 sont mises en évidence. c, Proportions relatives des six classes de noyaux. d, nombre de protéines différentiellement exprimées (test t bilatéral, n = 3 réplicats biologiques) par rapport aux noyaux non classés (en vrac). Les protéines avec un FDR inférieur à 0,05 ont été considérées comme significatives. e, Corrélation entre le nombre de protéines significativement régulées par classe de noyaux et la proportion relative de classe. Un modèle linéaire a été ajusté aux données montrant une corrélation inverse avec Pearson r = -0,96 (p-value = 0,01). f, Niveaux relatifs de protéines (z-score) de marqueurs connus du cycle cellulaire dans les cinq classes de noyaux. Tous les graphiques à barres représentent la moyenne des données (n = 3 répétitions biologiques) et les barres d'erreur sont des valeurs de p ANOVA sd sont affichées.

a, graphiques de violon montrant la zone nucléaire en pixels des 6 classes de noyaux identifiées par ML. b, Aire nucléaire en pixels des cellules U2OS FUCCI en relation avec le pseudo-temps du cycle cellulaire14. Le code couleur indique la densité de points. c, zone nucléaire de trois états majeurs du cycle cellulaire G1, G1/S et S/G2 déterminée par les intensités CDT1 et GMNN marquées par fluorescence et le regroupement gaussien. Les diagrammes en boîte montrent les résultats de n = 238 675 cellules au total (85 551 pour G1, 83 121 pour G1/S et 70 003 pour S/G2). d, Niveaux relatifs de protéines de toutes les protéines ORF identifiées dans l'ensemble de données. C7orf50, C1orf112, C19orf53 et C11orf98 ont été exprimés de manière différentielle (valeur p ANOVA < 0,05) dans les 5 classes de noyaux (n = 3 répétitions biologiques). e, intensités moyennes de C7orf50 coloré par immunofluorescence et des marqueurs du cycle cellulaire ANLN et CCNB1 dans les cellules U20S. Les niveaux de C7orf50 ont été quantifiés dans les noyaux avec des intensités ANLN et CNNB1 faibles et élevées. Les diagrammes en boîte montrent les résultats de n = 263 cellules par condition (C7orf50-ANLN) et n = 412 par condition (C7orf50-CCNB1). f, panneau supérieur : images d'immunofluorescence représentatives de cellules U2OS colorées C7orf50 et ADN (DAPI)19. La barre d'échelle est de 20 µm. Remarque, C7orf50 est enrichi en nucléoles. Panneau inférieur : Immunohistochimie d'un adénocarcinome pancréatique coloré au C7orf50 (https://bit.ly/2X4re05). Crédit image : Atlas des protéines humaines. La barre d'échelle est de 40 µm. g, analyse de survie de Kaplan-Meier de l'adénocarcinome pancréatique (https://bit.ly/3BAxewA) basée sur les niveaux relatifs d'ARN C7orf50 (FPKM, nombre de fragments par kilobase d'exon par million de lectures). Les données d'ARN-seq sont rapportées sous forme de FPKM médian, générées par The Cancer Genome Atlas (https://bit.ly/3iSOG8d). Les patients ont été divisés en deux groupes en fonction des niveaux de C7orf50 avec n = 41 patients faibles et n = 135 patients élevés. Un test du log-rank a été calculé avec p = 0,0001. h, analyse de l'interactome de chaîne pour C7orf50. Un score de confiance élevé de 0,7 a été utilisé avec les cinq interactions les plus proches mises en évidence par color54. Les boîtes à moustaches en c et e définissent la plage des données (moustaches), les 25e et 75e centiles (boîte) et les médianes (ligne continue). Les valeurs aberrantes sont tracées sous forme de points individuels à l'extérieur des moustaches.

a, coloration immunohistochimique de la glande salivaire normale colorée pour la protéine d'adhésion cellulaire EpCAM. Supervisé (forêt aléatoire) ML a été formé pour identifier les cellules acineuses (vert) et canalaires (turquoise). Barre d'échelle = 20µm. b, Comparaison protéomique quantitative entre les cellules acineuses et canalaires du tissu en A avec des marqueurs spécifiques de type cellulaire connus mis en évidence (https://bit.ly/3iOK8Qf). c, Niveaux relatifs de protéines des voies sélectionnées qui étaient significativement plus élevés dans les cellules acineuses ou canalaires. d, Regroupement hiérarchique non supervisé de protéomes de cellules acineuses et canalaires de deux patients différents avec des cellules de carcinome à cellules acineuses. Notez que les cellules acineuses normales de deux tissus différents se sont regroupées. Les cellules canalaires sont regroupées les plus éloignées. Avant le regroupement, les niveaux de protéines de différents groupes d'échantillons (tissu cellulaire des conduits n ° 1, tissu cellulaire acineux n ° 1, tissu cellulaire acineux n ° 2, tissu carcinome n ° 2) ont été moyennés et notés z. La barre de gauche montre les voies exprimées de manière différentielle du panneau b avec des protéines spécifiques aux acini et aux conduits en vert et turquoise, respectivement.

a, Isolement de mélanocytes positifs SOX10 adjacents à la tumeur à partir d'un tissu de mélanome cutané. Gauche : Alignement des contours avant la microdissection au laser. A droite : Inspection après microdissection laser. b, nombre de quantifications de protéines par type d'échantillon avec n = 4 (mélanocytes), n = 5 (stroma), n = 5 (mélanome in situ) et n = 13 (mélanome) répliques indépendantes. Les graphiques à barres représentent la moyenne des données et les barres d'erreur sont sd Les échantillons ont été acquis en mode indépendant des données et analysés avec le logiciel DIA-NN. c, panneau supérieur : carte thermique de la Fig. 5h illustrée avec des grappes de protéines identifiées (barre de couleur). Regroupement hiérarchique non supervisé basé sur les 1 910 groupes de protéines significatifs ANOVA (FDR < 0,05). Les niveaux de protéines ont été notés z. Panneau inférieur : analyse de l'enrichissement des voies de différents groupes de lignes obtenus par regroupement hiérarchique non supervisé. Le package ReactomePA a été utilisé pour l'analyse d'enrichissement avec un seuil FDR de 0,05 pour tous les termes enrichis. d, Niveaux relatifs (z-score) de protéines liées au terme KEGG « mélanogénèse ». Notez que les mélanocytes présentent les niveaux de protéines les plus élevés. Les diagrammes en boîte définissent la plage des données (moustaches), les 25e et 75e centiles (boîte) et les médianes (ligne continue). Les valeurs aberrantes sont tracées sous forme de points individuels à l'extérieur des moustaches. e, analyse de l'enrichissement de la voie des protéines régulées à la hausse ou à la baisse dans les cellules de mélanome à croissance verticale ou radiale. Les résultats d'enrichissement ont été obtenus avec le package ClusterProfiler R36 sur la base d'un FDR < 0,05.

Informations BIAIS

Isolation automatisée à un seul noyau LMD

Isolement automatisé à cellule unique LMD

Précision de référence de l'approche de segmentation à l'aide de la métrique F1 et comparaison des résultats avec trois méthodes supplémentaires

Analyse de l'enrichissement des voies pour les protéines significativement plus élevées dans les cellules ciliées par rapport aux cellules épithéliales sécrétoires des trompes de Fallope sur la base d'un test exact de Fisher avec un Benjamini-Hochberg FDR < 0,05

Résultats de l'analyse d'enrichissement des voies pour les protéines régulées de manière différentielle entre les classes de noyau sur la base d'un test exact de Fisher avec un FDR de Benjamini – Hochberg < 0,05

Protéines régulées de manière différentielle entre les classes de noyau sur la base d'une analyse ANOVA avec un FDR basé sur la permutation < 0,05

Résultats de l'analyse d'enrichissement des voies pour les protéines régulées de manière différentielle entre les cellules acineuses et canalaires de la glande salivaire saine sur la base d'un test Wilcoxon-Mann-Whitney bilatéral (deux échantillons) avec un FDR de Benjamini-Hochberg < 0,05

Protéines régulées différemment entre le carcinome à cellules acineuses et les cellules acineuses normales. Un test t bilatéral a été réalisé avec un FDR basé sur la permutation < 0,05

Analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes des voies Reactome (ReactomePA) pour le mélanome in situ par rapport au mélanome primaire. Les voies avec une valeur P ajustée au FDR de <0,05 sont affichées

Protéines régulées de manière différentielle parmi toutes les classes de cellules du mélanome primaire sur la base d'une analyse ANOVA avec un FDR basé sur la permutation < 0,05

Résultats de l'analyse d'enrichissement des voies pour les protéines dans les deux groupes de cartes thermiques mis en évidence de la Fig. 5i sur la base d'un test exact de Fisher avec un Benjamini – Hochberg FDR <0, 05

Analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes des voies de réactome (ReactomePA) pour les cellules de mélanome de la phase de croissance verticale par rapport à radiale. Les voies avec une valeur P ajustée au FDR de <0,05 sont affichées

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Réimpressions et autorisations

Mund, A., Coscia, F., Kriston, A. et al. Deep Visual Proteomics définit l'identité et l'hétérogénéité d'une seule cellule. Nat Biotechnol 40, 1231-1240 (2022). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01302-5

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Reçu : 08 mars 2022

Accepté : 30 mars 2022

Publié: 19 mai 2022

Date d'émission : août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41587-022-01302-5

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